Factori de interferență în reacțiile PCR

În timpul reacției PCR, apar adesea anumiți factori interferenți.
Datorită sensibilității foarte ridicate a PCR, contaminarea este considerată a fi unul dintre cei mai importanți factori care afectează rezultatele PCR și poate produce rezultate fals pozitive.
La fel de importante sunt diversele surse care duc la rezultate fals negative. Dacă una sau mai multe părți esențiale ale amestecului PCR sau ale reacției de amplificare în sine sunt inhibate sau interferate, testul de diagnostic poate fi împiedicat. Acest lucru poate duce la o eficiență redusă și chiar la rezultate fals negative.
Pe lângă inhibare, pierderea integrității acidului nucleic țintă poate apărea din cauza condițiilor de transport și/sau depozitare anterioare preparării probei. În special, temperaturile ridicate sau depozitarea inadecvată pot duce la deteriorarea celulelor și a acizilor nucleici. Fixarea celulelor și țesuturilor și includerea în parafină sunt cauze bine cunoscute ale fragmentării ADN-ului și o problemă persistentă (vezi Figurile 1 și 2). În aceste cazuri, nici măcar izolarea și purificarea optime nu vor ajuta.

Figura 1 | Efectul imobilizării asupra integrității ADN-ului
Electroforeza pe gel de agaroză a arătat că, în funcție de metoda de fixare, în extracte a fost prezent ADN cu lungimi medii diferite ale fragmentelor. ADN-ul a fost păstrat numai atunci când a fost fixat în probe congelate native și în formalină neutră tamponată. Utilizarea unui fixativ Bouin puternic acid sau a formalinei netamponate, care conține acid formic, a dus la o pierdere semnificativă de ADN. Fracția rămasă este foarte fragmentată.
În stânga, lungimea fragmentelor este exprimată în perechi de kilobaze (kbp)

Figura 2 | Pierderea integrității țintelor de acid nucleic
(a) O lacună 3′-5′ pe ambele catene va duce la o ruptură a ADN-ului țintă. Sinteza ADN-ului va avea loc în continuare pe fragmentul mic. Cu toate acestea, dacă lipsește un situs de legare a primerului pe fragmentul de ADN, are loc doar amplificarea liniară. În cel mai favorabil caz, fragmentele se pot resatura reciproc, dar randamentele vor fi mici și sub nivelurile de detecție.
(b) Pierderea bazelor, în principal din cauza depurinării și formării dimerului de timidină, duce la o scădere a numărului de legături de hidrogen și la o scădere a Tm. În timpul fazei de încălzire prelungită, primerii se vor topi de ADN-ul matriceal și nu se vor recoace nici măcar în condiții mai puțin stringente.
(c) Bazele timinice adiacente formează un dimer TT.
O altă problemă frecventă care apare adesea în diagnosticul molecular este eliberarea suboptimă a acizilor nucleici țintă în comparație cu extracția cu fenol-cloroform. În cazuri extreme, acest lucru poate fi asociat cu rezultate fals negative. Se poate economisi mult timp prin liza prin fierbere sau digestia enzimatică a resturilor celulare, dar această metodă are adesea ca rezultat o sensibilitate PCR scăzută din cauza eliberării insuficiente de acid nucleic.

Inhibarea activității polimerazei în timpul amplificării

În general, inhibarea este utilizată ca un concept conținător pentru a descrie toți factorii care duc la rezultate PCR suboptimale. Într-un sens strict biochimic, inhibarea este limitată la activitatea enzimei, adică reduce sau previne conversia substrat-produs prin interacțiunea cu situsul activ al ADN polimerazei sau cu cofactorul acesteia (de exemplu, Mg2+ pentru ADN polimeraza Taq).
Componentele din probă sau diversele soluții tampon și extracte care conțin reactivi pot inhiba direct enzima sau pot capta cofactorii acesteia (de exemplu, EDTA), inactivând astfel polimeraza și, la rândul său, ducând la rezultate PCR scăzute sau fals negative.
Totuși, multe interacțiuni dintre componentele reacției și acizii nucleici care conțin țintă sunt denumite și „inhibitori PCR”. Odată ce integritatea celulei este perturbată prin izolare și acidul nucleic este eliberat, pot apărea interacțiuni între probă și soluția și faza solidă din jur. De exemplu, „captorii” se pot lega de ADN monocatenar sau bicatenar prin interacțiuni necovalente și pot interfera cu izolarea și purificarea prin reducerea numărului de ținte care ajung în cele din urmă în vasul de reacție PCR.
În general, inhibitorii PCR sunt prezenți în majoritatea fluidelor corporale și reactivi utilizați pentru testele de diagnostic clinic (uree în urină, hemoglobină și heparină în sânge), suplimente alimentare (componente organice, glicogen, grăsimi, ioni de Ca2+) și componente din mediu (fenoli, metale grele).

Inhibitorii PCR mai răspândiți pot fi găsiți în bacterii și celule eucariote, ADN nețintă, macromolecule de legare a ADN-ului din matricele tisulare și echipamente de laborator, cum ar fi mănușile și materialele plastice. Purificarea acizilor nucleici în timpul sau după extracție este metoda preferată pentru îndepărtarea inhibitorilor PCR.
Astăzi, diverse echipamente automate de extracție pot înlocui multe protocoale manuale, dar recuperarea și/sau purificarea 100% a țintelor nu a fost niciodată atinsă. Inhibitorii potențiali pot fi încă prezenți în acizii nucleici purificați sau este posibil să fi avut deja efectul. Există diferite strategii pentru a reduce impactul inhibitorilor. Alegerea polimerazei adecvate poate avea un impact semnificativ asupra activității inhibitorilor. Alte metode dovedite de reducere a inhibării PCR sunt creșterea concentrației de polimerază sau aplicarea de aditivi precum BSA.
Inhibarea reacțiilor PCR poate fi demonstrată prin utilizarea controlului intern al calității procesului (IPC).
Trebuie avută grijă la îndepărtarea tuturor reactivilor și a altor soluții din kitul de extracție, cum ar fi etanolul, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolul și fenolul, din izolatul de acid nucleic printr-o etapă de spălare temeinică. În funcție de concentrația lor, aceștia pot activa sau inhiba PCR.