Factori de interferență în reacțiile PCR

În timpul reacției PCR, unii factori de interferență sunt adesea întâlniți.
Datorită sensibilității foarte ridicate a PCR, contaminarea este considerată a fi unul dintre cei mai importanți factori care afectează rezultatele PCR și poate produce rezultate false pozitive.
La fel de critice sunt diferitele surse care duc la rezultate fals-negative. Dacă una sau mai multe părți esențiale ale amestecului PCR sau reacția de amplificare în sine sunt inhibate sau interferate, testul de diagnostic poate fi împiedicat. Acest lucru poate duce la o eficiență redusă și chiar la rezultate false negative.
În plus față de inhibiție, poate apărea pierderea integrității acidului nucleic țintă din cauza condițiilor de transport și/sau depozitare înainte de prepararea eșantionului. În special, temperaturile ridicate sau depozitarea inadecvată pot duce la deteriorarea celulelor și a acizilor nucleici. Fixarea celulelor și a țesuturilor și încorporarea parafinei sunt cauze bine cunoscute ale fragmentării ADN -ului și o problemă persistentă (vezi Figurile 1 și 2). În aceste cazuri, chiar și o izolare și purificare optimă nu vă vor ajuta.

Figura 1 | Efectul imobilizării asupra integrității ADN -ului
Electroforeza cu gel de agaroză a arătat că calitatea ADN -ului izolat din secțiunile de parafină a autopsiilor a variat considerabil. ADN -ul de diferite lungimi medii de fragment a fost prezent în extracte în funcție de metoda de fixare. ADN -ul a fost păstrat numai atunci când este fixat în probe congelate autohtone și în formalină neutră tamponată. Utilizarea unei formaline a acidului puternic acid sau nelegalate, care conține acid formic, a dus la o pierdere semnificativă a ADN-ului. Fracția rămasă este foarte fragmentată.
În stânga, lungimea fragmentelor este exprimată în perechi kilobase (KBP)

Figura 2 | Pierderea integrității țintelor acidului nucleic
(a) Un decalaj 3'-5 ′ pe ambele șuvițe va duce la o pauză a ADN-ului țintă. Sinteza ADN -ului va apărea în continuare pe fragmentul mic. Cu toate acestea, dacă lipsește un loc de recoacere a primerului pe fragmentul de ADN, are loc doar amplificarea liniară. În cel mai favorabil caz, fragmentele se pot relua reciproc, dar randamentele vor fi mici și sub nivelurile de detectare.
(b) Pierderea bazelor, în principal din cauza deciziei și a formării dimerului timidinei, duce la o scădere a numărului de legături H și la o scădere a TM. În timpul fazei de încălzire alungită, primerii se vor topi departe de ADN -ul matricei și nu se vor anexa nici măcar în condiții mai puțin stricte.
(c) Bazele de timină adiacente formează un dimer TT.
O altă problemă comună care apare adesea în diagnosticul molecular este eliberarea mai puțin decât optimă de acizi nucleici țintă în comparație cu extracția fenol-cloroform. În cazuri extreme, acest lucru poate fi asociat cu false negative. Mult timp poate fi salvat prin fierberea lizei sau digestiei enzimatice a resturilor celulare, dar această metodă are ca rezultat adesea o sensibilitate scăzută a PCR din cauza eliberării insuficiente de acid nucleic.

Inhibarea activității polimerazei în timpul amplificării

În general, inhibarea este utilizată ca concept de containere pentru a descrie toți factorii care duc la rezultate suboptimale ale PCR. Într-un sens strict biochimic, inhibarea este limitată la activitatea enzimei, adică reduce sau previne conversia produsului substrat prin interacțiunea cu locul activ al ADN-polimerazei sau cofactorul său (de exemplu, Mg2+ pentru ADN polimerazei).
Componentele din eșantion sau diverse tampoane și extracte care conțin reactivi pot inhiba direct enzima sau pot captura cofactorii acesteia (de exemplu, EDTA), inactivând astfel polimeraza și, la rândul său, ceea ce duce la scăderea sau falsa PCR negativă negativă.
Cu toate acestea, multe interacțiuni între componentele de reacție și acizii nucleici care conțin țintă sunt, de asemenea, desemnate ca „inhibitori ai PCR”. Odată ce integritatea celulei este perturbată de izolare și acidul nucleic este eliberat, pot apărea interacțiuni între eșantion și soluția înconjurătoare și faza solidă. De exemplu, „Scavengerii” pot lega ADN-ul cu o singură sau dublu catenar prin interacțiuni non-covalente și interferează cu izolarea și purificarea prin reducerea numărului de ținte care ajung în cele din urmă la vasul de reacție PCR.
În general, inhibitorii PCR sunt prezenți în majoritatea lichidelor corporale și a reactivilor folosiți pentru testele de diagnostic clinic (uree în urină, hemoglobină și heparină în sânge), suplimente alimentare (componente organice, glicogen, grăsimi, ioni CA2+) și componente în mediu (fenoli, metale grele)

Inhibitori PCR mai răspândiți pot fi găsiți în bacterii și celule eucariote, ADN non-țintă, macromolecule care leagă ADN-ul matricilor de țesut și echipamente de laborator, cum ar fi mănuși și materiale plastice. Purificarea acizilor nucleici în timpul sau după extracție este metoda preferată pentru îndepărtarea inhibitorilor PCR.
Astăzi, diverse echipamente de extracție automate pot înlocui multe protocoale manuale, dar recuperarea 100% și/sau purificarea țintelor nu au fost niciodată realizate. Inhibitorii potențiali pot fi încă prezenți în acizii nucleici purificați sau pot fi deja efect. Există diferite strategii pentru a reduce impactul inhibitorilor. Alegerea polimerazei adecvate poate avea un impact semnificativ asupra activității inhibitorilor. Alte metode dovedite pentru a reduce inhibarea PCR sunt creșterea concentrației de polimerază sau aplicarea aditivilor precum BSA.
Inhibarea reacțiilor PCR poate fi demonstrată prin utilizarea controlului intern al calității procesului (IPC).
Trebuie să aveți grijă pentru a elimina toți reactivii și alte soluții din kitul de extracție, cum ar fi etanolul, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, izopropanolul și fenolul, din izolatul acidului nucleic printr -o etapă de spălare minuțioasă. În funcție de concentrația lor, pot activa sau inhiba PCR.