Factori de interferență în reacțiile PCR

În timpul reacției PCR, sunt adesea întâlniți unii factori de interferență.
Datorită sensibilității foarte ridicate a PCR, contaminarea este considerată a fi unul dintre cei mai importanți factori care afectează rezultatele PCR și poate produce rezultate fals pozitive.
La fel de critice sunt diversele surse care duc la rezultate fals-negative. Dacă una sau mai multe părți esențiale ale amestecului PCR sau reacția de amplificare în sine sunt inhibate sau interferate, testul de diagnosticare poate fi împiedicat. Acest lucru poate duce la o eficiență redusă și chiar la rezultate fals negative.
Pe lângă inhibare, poate apărea pierderea integrității acidului nucleic țintă din cauza condițiilor de transport și/sau depozitare înainte de pregătirea probei. În special, temperaturile ridicate sau depozitarea inadecvată pot duce la deteriorarea celulelor și a acizilor nucleici. Fixarea celulelor și țesuturilor și încorporarea parafinei sunt cauze bine cunoscute ale fragmentării ADN-ului și o problemă persistentă (vezi figurile 1 și 2). În aceste cazuri, chiar și izolarea și purificarea optime nu vor ajuta.

Figura 1 | Efectul imobilizării asupra integrității ADN-ului
Electroforeza pe gel de agaroză a arătat că calitatea ADN-ului izolat din secțiunile de parafină ale autopsiilor a variat considerabil. ADN de diferite lungimi medii ale fragmentelor a fost prezent în extracte, în funcție de metoda de fixare. ADN-ul a fost conservat numai atunci când a fost fixat în probe native congelate și în formalină neutră tamponată. Utilizarea unui fixativ Bouin puternic acid sau formalină netamponată, care conține acid formic, a dus la o pierdere semnificativă de ADN. Fracția rămasă este foarte fragmentată.
În stânga, lungimea fragmentelor este exprimată în perechi de kilobaze (kbp)

Figura 2 | Pierderea integrității țintelor de acid nucleic
(a) Un spațiu de 3′-5′ pe ambele catene va duce la o rupere a ADN-ului țintă. sinteza ADN-ului va avea loc în continuare pe fragmentul mic. Cu toate acestea, dacă un loc de recoacere a primerului lipsește pe fragmentul de ADN, are loc doar amplificarea liniară. În cel mai favorabil caz, fragmentele se pot resatura unele pe altele, dar randamentele vor fi mici și sub nivelurile de detectare.
(b) Pierderea bazelor, în principal din cauza depurinării și formării dimerului de timidină, duce la o scădere a numărului de legături H și la o scădere a Tm. În timpul fazei de încălzire alungită, primerii se vor topi departe de ADN-ul matricei și nu se vor recoa chiar și în condiții mai puțin stricte.
(c) Bazele adiacente de timină formează un dimer TT.
O altă problemă comună care apare adesea în diagnosticul molecular este eliberarea mai puțin decât optimă a acizilor nucleici țintă în comparație cu extracția cu fenol-cloroform. În cazuri extreme, acest lucru poate fi asociat cu fals negative. Se poate economisi mult timp prin liza prin fierbere sau digestia enzimatică a resturilor celulare, dar această metodă are adesea ca rezultat o sensibilitate scăzută la PCR din cauza eliberării insuficiente a acidului nucleic.

Inhibarea activității polimerazei în timpul amplificării

În general, inhibiția este utilizată ca un concept de container pentru a descrie toți factorii care conduc la rezultate suboptime ale PCR. Într-un sens strict biochimic, inhibarea este limitată la activitatea enzimei, adică reduce sau previne conversia substrat-produs prin interacțiunea cu situsul activ al ADN polimerazei sau al cofactorului său (de exemplu, Mg2+ pentru ADN polimeraza Taq).
Componentele din probă sau diferitele tampoane și extracte care conțin reactivi pot inhiba direct enzima sau pot prinde cofactorii acesteia (de exemplu EDTA), astfel inactivând polimeraza și conducând la rândul său la rezultate PCR scăzute sau fals negative.
Cu toate acestea, multe interacțiuni dintre componentele reacției și acizii nucleici care conțin țintă sunt, de asemenea, denumite „inhibitori PCR”. Odată ce integritatea celulei este perturbată prin izolare și acidul nucleic este eliberat, pot apărea interacțiuni între probă și soluția înconjurătoare și faza solidă. De exemplu, „scavengers” pot lega ADN-ul simplu sau dublu catenar prin interacțiuni non-covalente și pot interfera cu izolarea și purificarea prin reducerea numărului de ținte care ajung în cele din urmă la vasul de reacție PCR.
În general, inhibitorii PCR sunt prezenți în majoritatea fluidelor corporale și a reactivilor utilizați pentru testele de diagnostic clinic (uree în urină, hemoglobină și heparină în sânge), suplimente alimentare (componente organice, glicogen, grăsimi, ioni de Ca2+) și componente din mediu (fenoli, metale grele)

Inhibitorii PCR mai răspândiți pot fi găsiți în bacterii și celule eucariote, ADN-ul non-țintă, macromoleculele de legare ADN ale matricelor de țesut și echipamente de laborator, cum ar fi mănuși și materiale plastice. Purificarea acizilor nucleici în timpul sau după extracție este metoda preferată pentru îndepărtarea inhibitorilor PCR.
Astăzi, diverse echipamente automate de extracție pot înlocui multe protocoale manuale, dar recuperarea și/sau purificarea 100% a țintelor nu a fost niciodată atinsă. Inhibitorii potențiali pot fi încă prezenți în acizii nucleici purificați sau ar putea să fi avut deja efect. Există diferite strategii pentru a reduce impactul inhibitorilor. Alegerea polimerazei adecvate poate avea un impact semnificativ asupra activității inhibitorului. Alte metode dovedite pentru a reduce inhibarea PCR sunt creșterea concentrației de polimerază sau aplicarea de aditivi precum BSA.
Inhibarea reacțiilor PCR poate fi demonstrată prin utilizarea controlului intern al calității procesului (IPC).
Trebuie avut grijă să îndepărtați toți reactivii și alte soluții din trusa de extracție, cum ar fi etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol și fenol, din izolatul de acid nucleic printr-o etapă de spălare minuțioasă. În funcție de concentrația lor, acestea pot activa sau inhiba PCR.